關于 ITC 技術的問與答

1、N值是不是一般都是1左右？N值是一個很大的負值是否正常？

答：ITC中的N值表示化學計量比，它取決于分子相互作用自身的性質。1:1結合的相互作用一般較多，所以多數分子互作的N值都是1，關于這類結合的研究也比較透徹。但是，當蛋白上含有兩個結合位點，或者蛋白由多個相同亞基組成時，N值可能更高。當N值遠小于1，多數情況下反映出被滴定物的活性濃度（活性構象等）遠低于100%。N值為負值不正常。

2、參比池放純水、緩沖會對實驗結果有不同影響嗎？

答：在ITC實驗中，對于水相體系的樣品而言（如常見的生物緩沖體系或者含10%以下有機溶劑如DMSO的體系），參比池一般只放脫過氣的純水并定期更換，不放緩沖液。參比池的作用是作為溫度的參照。做ITC的Control實驗(如滴定劑滴buffer)則需要單獨做一次滴定，這時參比池為水，樣品池為buffer。

3、有沒有軟件可以模擬預實驗，從而大致確定濃度？

答：PEAQ-ITC控制軟件中可以進行多種模型的ITC實驗模擬，如單套位點模型、兩套位點模型等，其模擬過程需要用戶輸入一些參數如大致的親和力范圍、化學計量比，濃度，C值等，可以作為大家學習的工具。如果使用其他型號的儀器如ITC200，則在Origin擬合界面有一個simulation的按鈕可以進行模擬。

4、DMSO是否會影響aptamer的識別能力？

答：DMSO作為助溶的有機溶劑在常用5-10%的濃度條件下一般不會影響分子間識別。但是，由于ITC測定是表觀吸放熱，我們需要確保滴定針和樣品池中均含有濃度一致的DMSO從而消除背景熱量。對于某些生物分子而言，一定濃度的DMSO有可能對分子構象和熱穩定性造成影響，從而導致構象的局部展開和非特異性結合的發生。因此，需要對DMSO環境下的生物分子穩定性做一些分析，如通過DSC以及光散射技術等。

5、核酸和蛋白互作，哪個放cell中？

答：ITC是一種平衡實驗，通過檢測因分子間相互作用吸收或者放出的熱量來計算相關的熱力學參數。ITC沒有分子量限制，樣品放置的原則通常由互作分子的價態、可用量、穩定性等決定。一般多價態的分子放在樣品池比較有利于分析，具有較高濃度且穩定的樣品作為滴定針的物質。對于1:1反應而言，我們更建議大家在樣品允許的情況下，既做正向滴定也做反向滴定（Reverse Titration）進行交互驗證。

6、儀器能加熱Decon-90嗎？還是自己手動加熱？

答：用14% (v/v)的Decon-90清洗液加熱泡洗樣品池是一種非常有效去除生物聚集體和沉淀物的方法。對于PEAQ-ITC的用戶，選擇Soak即可實現自動加熱泡洗和純水清洗；對于ITC 200和VP-ITC的用戶，需要手動將Decon-90加入樣品池并調整其溫度至50-60℃，浸泡20分鐘后執行Wash (long)操作進行樣品池清洗。

7、能否根據KD值知道小分子與蛋白是弱結合，強結合，還是不結合？如果可以的話，具體的范圍是多少呀？

答：這個問題的答案并不只有一個，通常根據經驗來確定。一般來說，我們認為nM級別左右的親和力屬于強結合；μM級別左右的親和力屬于中等強度結合；mM級別左右的親和力屬于弱結合。各種強度親和力之間的界限并不絕對，相互會有交疊。小分子與蛋白質結合力的親和力范圍非常廣，有的親和力較弱，在幾百μM；有的親和力較強，在pM。

8、蛋白和藥物的濃度一般怎么選擇？

答：蛋白和藥物的濃度選擇在ITC實驗中一般要根據兩種分子結合的大致親和力KD來進行估算。若您手頭有IC50，SPR（表面等離子體共振），GCI (光柵耦合干涉)等實驗數據，您可以將它用作預估KD的參考，并基于C值來設計ITC實驗。如果沒有任何參考數據，建議首先嘗試200 μM藥物滴定20 μM蛋白的條件。

9、遇到始終滴不到飽和的樣品應該怎么辦？

答：ITC滴定曲線的形態取決于分子間互作的親和力。對于具有中等偏弱親和力的分子互作，我們會得到無法滴定到飽和的ITC結果。這很正常。對于滴定不到飽和的樣品，您可以首先做滴定物滴buffer的Control實驗以確認是否有背景放熱；對于背景放熱較小的滴定，提高滴定物與被滴定物的濃度比例通常可以更好的看到信號飽和的趨勢；您也可以連續滴定2-3個ITC結果，比如：實驗一、A滴B；實驗二、A滴 實驗一滴定完樣品池中A/B混合樣品，然后通過Concat軟件（在Malvern Panalytical網站上下載）將兩次ITC實驗的滴定結果連接起來作為一個實驗數據進行分析。在分析不飽和數據時，通常需要固定化學計量比N值，如1。（請根據分子結合的生物學背景進行N值的確認）

10、樣品濃度，參數設置，還有哪些注意事項？

答：這幾項內容在講座中介紹的比較清楚，請參考視頻中“如何做好一個ITC實驗"部分。